În biologia moleculară, alegerea bunului tampon și pregătirea pentru diferite etape de izolare a ADN-ului poate fi diferența dintre trecerea la expresia proteinei sau deschiderea unui alt kit de maxi-prep pentru a începe de la început. În ciuda importanței lor cruciale, rețetele tampon sunt adesea doar acele rețete scrise fără explicații sau raționamente pentru diferitele componente. Un astfel de tampon este glucoza-tris-EDTA sau tampon GTE.
$config[code] not foundPentru ce este folosit GTE?
GTE se utilizează pentru a resuspenda peletele de celule bacteriene înainte de lizare (rupere deschisă) a celulelor și recoltarea ADN-ului plasmidic în interior. Lizozimul, care înmoaie membranele celulare, este adesea adăugat împreună cu tamponul GTE. Realizarea unei suspensii omogene de celule întregi în timpul acestei etape, astfel încât soluția de liză adăugată ulterior să ajungă la toate celulele, este cheia obținerii unor randamente bune de ADN. GTE este conceput pentru a face acest lucru în timp ce oferă, de asemenea, un mediu stabil pentru ADN-ul.
Glucoză pentru osmolaritate
50mM (milimolar) zahar de glucoză este adăugat la tamponul GTE pentru a menține osmolaritatea în care concentrația dizolvată în afara celulelor este apropiată de cea din interiorul celulelor. Acest lucru previne liza celulară prematură, ceea ce poate duce la scăderea randamentului ADN datorat agregării și degradării. Celelalte componente ale tamponului contribuie, de asemenea, la osmolaritatea soluției, dar glucoza, fiind un non-electrolitic, este o alegere bună deoarece nu interferează cu proprietățile tampon ale soluției.
Tris pentru stabilitatea pH-ului
Tris este numele scurt pentru tris (hidroximetil) aminometan, care este un tampon de pH foarte comun. În cazul tamponului GTE, sarea acidă (Tris-HCI) este adăugată la tampon la o concentrație de 25 mM. Acest lucru menține pH-ul soluției la un nivel aproape fiziologic de 8,0, un pH ideal pentru prevenirea hidrolizei acide (degradarea) ADN-ului plasmidic și a reacțiilor secundare nedorite ale celorlalte componente ale celulei.
EDTA previne degradarea ADN-ului
EDTA sau acidul etilendiaminotetraacetic, captează sau "chelates" ionii metalici din soluție, împiedicându-i să participe la reacții secundare nedorite. În tampon GTE, se adaugă EDTA la 10 mM. Scopul său principal este în tampon pentru a rotunzi zinc, magneziu și calciu liber, împiedicând astfel degradarea ADN-ului prin anumite căi care necesită aceste metale.
Unele sfaturi importante
Păstrați tamponul GTE rece și faceți-l în cantități mici pentru a preveni creșterea bacteriilor neintenționate în el. Zaharul si pH-ul controlat fac un mediu de crestere foarte bun. Utilizați întotdeauna apă purificată. Apa de la robinet poate avea un exces de ioni metalici din țevi, care pot copleși capacitatea EDTA de a capta. Dacă suspectați prezența ARN-ului interferant în eșantionul dvs., adăugați RNase A la 100 micrograme pe mililitru la tamponul GTE pentru a elimina problema.
